長(zhǎng)三角G60激光聯(lián)盟導(dǎo)讀

這是一項(xiàng)來(lái)自意大利米蘭理工大學(xué)的研究成果。

B-CARS實(shí)驗(yàn)裝置方案。HWP：半波片；PBS：偏振分束器；LP：長(zhǎng)通濾波器；SP：短通濾波器。泵浦（紅色）和斯托克斯（彩虹）光譜。數(shù)據(jù)處理流程示意圖：（i）神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，（ii）NRB去除和（iii）獲得假彩色圖像的分類(lèi)方法。來(lái)源：Federico Vernuccio et al, Optics Express (2022). DOI: 10.1364/OE.463032

近期，來(lái)自意大利米蘭理工大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)昕開(kāi)發(fā)了一種方法，他們發(fā)現(xiàn)，他們的研究可以為臨床使用提供一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)標(biāo)簽和用戶友好的設(shè)備。這種創(chuàng)新的顯微鏡，加上基于深度學(xué)習(xí)的算法，可以通過(guò)可視化人體組織和細(xì)胞的化學(xué)成分，使診斷癌癥變得更容易、更快。

他們的研究發(fā)表在《光學(xué)快報(bào)》雜志上。在文中，他們的新技術(shù)被描述，該技術(shù)基于相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）顯微鏡。CARS顯微鏡利用超短激光脈沖與生物樣品之間的相互作用，根據(jù)分子的振動(dòng)特征生成圖像。

新方法提供了對(duì)振動(dòng)光譜中難以檢測(cè)的區(qū)域的訪問(wèn)，該區(qū)域稱為指紋區(qū)域，跨度從400到1800cm?1。雖然許多單獨(dú)的化合物可以使用其在該區(qū)域的振動(dòng)指紋來(lái)識(shí)別，但它往往會(huì)產(chǎn)生難以檢測(cè)的微弱信號(hào)。

Polli說(shuō)：“生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中常用的技術(shù)通常需要染色，這不僅麻煩，而且還可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和化學(xué)變化，從而導(dǎo)致成像和數(shù)據(jù)處理中的偽影或錯(cuò)誤。由于我們的系統(tǒng)可以在沒(méi)有標(biāo)記的情況下區(qū)分生物組織中的許多不同化學(xué)物質(zhì)，因此它可以用于活細(xì)胞成像和組織活檢分析?！?/span>

更低的重復(fù)率，更快的成像

這項(xiàng)新工作是CRIMSON項(xiàng)目的一部分，該項(xiàng)目旨在開(kāi)發(fā)一種交鑰匙成像設(shè)備，該設(shè)備使用振動(dòng)光譜技術(shù)進(jìn)行快速細(xì)胞和組織分類(lèi)。該項(xiàng)目的目標(biāo)是改變對(duì)疾病細(xì)胞起源的研究，以使新的方法能夠推進(jìn)個(gè)性化治療。

寬帶CARS圖像為10μm PS和8μm PMMA微珠浸泡在DMSO中，夾在兩個(gè)170μm玻璃蓋玻片之間。

作為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的關(guān)鍵一步，研究人員開(kāi)發(fā)了一種基于商用激光器的CARS顯微鏡，該顯微鏡在近紅外波長(zhǎng)范圍內(nèi)產(chǎn)生持續(xù)時(shí)間約為270飛秒的超短脈沖。他們將顯微鏡系統(tǒng)設(shè)計(jì)為使用重復(fù)頻率為2MHz的激光脈沖，這遠(yuǎn)低于大多數(shù)其他CARS系統(tǒng)使用的40或80MHz。

這種較低的重復(fù)率減少了樣品的光熱損傷，因?yàn)樗趦蓚€(gè)連續(xù)脈沖之間產(chǎn)生了0.5微秒的延遲。它還在焦點(diǎn)處產(chǎn)生更高的脈沖能量和峰值強(qiáng)度，從而產(chǎn)生更強(qiáng)的CARS信號(hào)并允許更快的采集速度。

米蘭理工大學(xué)的博士生、該研究的**作者Federico Vernuccio說(shuō)：“低重復(fù)率很重要的優(yōu)點(diǎn)是，它允許我們通過(guò)在大塊晶體中產(chǎn)生白光超連續(xù)譜來(lái)產(chǎn)生覆蓋整個(gè)指紋振動(dòng)區(qū)域的寬帶紅移斯托克斯脈沖。與其他方法相比，這種方法在技術(shù)上更簡(jiǎn)單、更緊湊、更穩(wěn)健。”

使用與標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置相比紅移的光譜區(qū)域意味著在光損傷開(kāi)始之前可以使用更高的激光強(qiáng)度。研究人員還開(kāi)發(fā)了將標(biāo)準(zhǔn)數(shù)值計(jì)算方法與人工智能相結(jié)合的新算法。這些算法從獲取的數(shù)據(jù)中檢索更多信息，并將其轉(zhuǎn)化為圖像，從而可以輕松區(qū)分不同的化學(xué)物種。

“由于我們的改進(jìn)，CARS系統(tǒng)以很先進(jìn)的采集速度提供了高質(zhì)量的圖像，”Vernuccio說(shuō)。“我們的系統(tǒng)在不影響樣本完整性的情況下，像素駐留時(shí)間小于1毫秒。此速度受光譜儀刷新率的限制。”

夾在兩個(gè)170μm石英蓋玻片之間的6μm厚小鼠脊柱的顯微鏡觀察。

高速靈敏度

為了測(cè)試他們的系統(tǒng)，研究人員使用參考樣品將新顯微鏡檢索到的光譜與使用很先進(jìn)但速度較慢的振動(dòng)光譜技術(shù)獲取的光譜進(jìn)行比較。這兩種方法顯示出極好的一致性，表明新系統(tǒng)可以以非常高的速度傳輸光譜，具有良好的光譜分辨率和化學(xué)特異性。

然后，研究人員通過(guò)獲取一組不同濃度的二甲基亞砜溶液的CARS光譜，確定了他們系統(tǒng)的檢測(cè)極限。該系統(tǒng)能夠以14.1mmol/升的****的靈敏度測(cè)量化學(xué)濃度，大約是在指紋區(qū)域工作的其他CARS系統(tǒng)的靈敏度的兩倍。

他們還展示了該系統(tǒng)基于其振動(dòng)特征識(shí)別和空間定位各種透明微米尺寸塑料珠的能力，并從生物組織中進(jìn)行了測(cè)量，以證明該技術(shù)在生物樣品上有效，不會(huì)造成損傷。

Polli說(shuō)：“我們的CARS顯微鏡允許以更高的速度進(jìn)行無(wú)標(biāo)記的化學(xué)特異性成像，從而使活細(xì)胞的拉曼成像更為可行。例如，這可以讓我們的系統(tǒng)用于分析癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞的相互作用，或描述化療對(duì)細(xì)胞的影響。”

（a）B-CARS原始單點(diǎn)光譜（藍(lán)色實(shí)線）在六種溶劑（如圖所示）上以0.8毫秒的曝光時(shí)間測(cè)量，夾在兩個(gè)170μm玻璃蓋玻片之間。紅色實(shí)線是非線性磁化率的相應(yīng)虛部，通過(guò)深度學(xué)習(xí)和Kramers-Kronig算法應(yīng)用去噪后檢索。還繪制了SR光譜（灰色區(qū)域）以進(jìn)行比較。（b）用于實(shí)驗(yàn)的樣本配置方案。（c） DMSO和純水二元溶液的稀釋試驗(yàn)。我們考慮了在667處DMSO主峰的三階共振磁化率的恢復(fù)虛部?厘米?1.插圖顯示了低濃度二元溶液的放大圖。估計(jì)靈敏度：14.1?mmol/L的DMSO在純水中。誤差條：1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

研究人員現(xiàn)在正致力于通過(guò)產(chǎn)生白光超連續(xù)譜來(lái)改善他們的系統(tǒng)，創(chuàng)造出更寬波長(zhǎng)范圍的斯托克斯脈沖。這將提高成像速度和可檢測(cè)化學(xué)分析物的數(shù)量。他們還通過(guò)開(kāi)發(fā)用戶友好的軟件、緊湊的光源以及商業(yè)原型和檢測(cè)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，努力實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。

來(lái)源：Fingerprint multiplex CARS at high speed based on supercontinuum generation in bulk media and deep learning spectral denoising, Optics Express (2022). DOI: 10.1364/OE.463032

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