來源：教育裝備采購網 作者：MedChemExpress 責任編輯：張肖
在細胞的“花樣”死亡方式一文中，小 M 已經介紹過細胞的死亡方式有十幾種，凋亡只是其中一種：細胞凋亡 (Apoptosis)，又稱程序性細胞死亡，是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序的死亡。
與被動的細胞壞死不同，細胞凋亡是主動發生的，是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程，期間涉及一系列基因的靈活、表達以及調控等。
圖 1. 細胞凋亡的信號通路[1]
細胞凋亡的主要形態學特征包括：染色質固縮、DNA 片段化、細胞膜起泡、細胞皺縮、凋亡小體的形成等。
圖 2. 細胞凋亡過程
細胞凋亡的檢測
細胞凋亡，我們該如何檢測呢?目前至少有數十種檢測細胞凋亡的方法，可以大致劃分為基于細胞形態、生物學功能和生化標記三大類。
■ 基于細胞形態學的方法
1.1 電子顯微鏡檢測
電鏡形態學觀察是迄今為止判斷凋亡經典、可靠的方法，被認為是確定細胞凋亡的金標準。細胞凋亡的主要形態學特征包括：染色質固縮、DNA 片段化、細胞膜起泡、細胞皺縮、凋亡小體的形成等。
圖 3. BBR 和 DDP 誘導下 OVCAR3 細胞的凋亡形態[2]
1.2 細胞核染色檢測
細胞凋亡時，細胞膜通透性增強，染色質發生固縮，故經 DAPI、Hoechst系列等熒光染料染色后可快速檢測細胞凋亡。除了實驗操作簡單、成本低廉之外，細胞核染色還可以定量。
圖 4. PC-3 細胞凋亡過程中核染色質的形態學變化[3]
注：Hoechst 33342 染色觀察到核碎裂和核凝結。用 0、0.3、0.6、0.9 和 1.2 mg/mL 的莖提取物處理 PC-3 細胞 24h 后，細胞出現典型的凋亡細胞核形態變化。照片在 20× 熒光顯微鏡下拍攝。箭頭表示凋亡細胞。
■ 基于生物學功能的方法
2.1 線粒體膜電位的檢測
凋亡早期細胞，線粒體膜通透性增加，線粒體膜電位 (ΔΨm) 下降甚至消失。線粒體膜電位的下降被認為是細胞凋亡過程中近早發生的生物學變化。一旦線粒體膜電位被破壞，細胞凋亡將不可逆轉。
目前常用一些親脂性陽離子染料如 JC-1 (HY-K0601) 檢測線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位較高時，JC-1 在基質中匯聚形成聚合物，可以產生紅色熒光 (Ex/Em=585/590 nm)；線粒體膜電位較低時，JC-1 不能聚集在線粒體基質中，以單體形式存在產生綠色熒光 (Ex/Em=510/527 nm)。
圖 5. JC-1法檢測 KRA-533刺激下不同細胞的線粒體膜電位變化[4]
2.2 細胞膜表面磷脂酰絲氨酸 (PS) 的檢測
在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸 (PS) 位于細胞膜內側；細胞凋亡早期，PS 會外翻到細胞膜外側。Annexin V (膜聯蛋白 V) 是一種 Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，可與 PS 特異性結合，因此 Annexin V 常作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。Annexin V 經 FITC 標記后可發綠色熒光。碘化丙啶 (Propidium Iodide, PI) 染色液是一種不能穿透細胞膜的紅色熒光染料，可對凋亡晚期細胞及壞死細胞染色。
經 Annexin V-FITC 和 PI 聯合染色后，正常細胞基本無熒光 (Annexin V-/PI-)，早期凋亡細胞呈綠色熒光 (Annexin V+/PI-)，晚期凋亡細胞及壞死細胞則呈綠色和紅色熒光 (Annexin V+/PI+)。
圖 6. 不同濃度臭椿酮誘導 A375 細胞的凋亡情況[5]
此外，除了用 FITC 標記 Annexin V 之外，也可以用 EGFP、PE、mCherry 等作為熒光探針哦。
■ 基于生化標記的方法
3.1 凋亡分子標記檢測
Caspase (cysteinyl-aspartic acid proteases) 蛋白家族在介導細胞凋亡過程中具有重要的作用。絕大多數情況下，所有的凋亡信號都會匯集到凋亡的執行者 Caspase-3 上。在正常細胞中，Caspase-3 以酶原形式存在，在凋亡早期 Caspase-3 被靈活，并執行過后的凋亡程序。因此可以通過檢測 Caspase 3 剪切體的含量或 Caspase 3 的活性來反應細胞凋亡過程。此外，也可以通過檢測 Caspase-3 的底物——PARP 蛋白的含量來檢測細胞凋亡。
圖 7. ZnO-NPs 誘導牙齦癌細胞的凋亡情況[6]
3.2 DNA 片段化檢測
在細胞凋亡的后期，Caspase 會靈活 Caspase-Activated DNase (CAD)，切割核小體之間的 DNA，形成以 180-200 bp 為單位的 DNA 片段，經瓊脂糖電泳后形成 DNA ladder。
圖 8. DNA 片段化檢測 MCP30 誘導下 Ishikawa H 細胞的凋亡情況[7]
注：泳道 1-4 分別表示 0 pM、8.33 pM、333.33 pM 和 666.67 pM MCP30 誘導 72h 的 Ishikawa H 細胞
3.3 DNA 片段原位檢測 (TUNEL 法)
細胞凋亡時，相關 DNA 內切酶被靈活，進而切斷核小體間的基因組 DNA，產生 180-200 bp 的 DNA ladder，暴露的 3’-OH 在末端脫氧核苷酸轉移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下加上特異熒光探針標記的 dUTP，借助熒光顯微鏡或流式細胞儀即可檢測細胞凋亡的發生。
圖 9. TUNEL 法檢測苦參堿刺激下 HepG2 細胞凋亡情況[8]
看了這么多，相信大家對細胞凋亡的檢測方法都有了大概的了解。
參考文獻
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3. Chainumnim S, Saenkham A, Dolsophon K, et al. Stem Extract from Momordica cochinchinensis Induces Apoptosis in Chemoresistant Human Prostate Cancer Cells (PC-3). Molecules. 2022, 27(4): 1313.
4. Xu K, Park D, Magis AT, et al. Small Molecule KRAS Agonist for Mutant KRAS Cancer Therapy. Mol Cancer. 2019, 18(1): 85.
5. Liu W, Liu X, Pan Z, et al. Ailanthone Induces Cell Cycle Arrest and Apoptosis in Melanoma B16 and A375 Cells. Biomolecules. 2019, 9(7): 275.
6. L SW, Lee CH, Lin MS, et al. ZnO Nanoparticles Induced Caspase-Dependent Apoptosis in Gingival Squamous Cell Carcinoma through Mitochondrial Dysfunction and p70S6K Signaling Pathway. Int J Mol Sci. 2020, 21(5): 1612.
7. Gu HZ, Lin RR, Wang HC, et al. Effect of Momordica charantia protein on proliferation, apoptosis and the AKT signal transduction pathway in the human endometrial carcinoma Ishikawa H cell line in vitro. Oncol Lett. 2017, 13(5): 3032-3038.
8. Wei R, Cao J, Yao S. Matrine promotes liver cancer cell apoptosis by inhibiting mitophagy and PINK1/Parkin pathways. Cell Stress Chaperones. 2018, 23(6): 1295-1309.
